國(guó)標(biāo)法測(cè)菌群總數(shù)是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合后，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個(gè)可見的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用37℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20％)，因而并不能測(cè)出每g或ml檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù)，厭氧菌、微嗜氧菌和冷營(yíng)菌在此條件下不生長(zhǎng)，有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制，因此所得結(jié)果，只包括一群能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。國(guó)標(biāo)法檢測(cè)應(yīng)注意以下問題：
1、菌落總數(shù)檢測(cè)所用器皿及稀釋液
檢驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是*滅菌的，并在滅菌前*洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對(duì)照。如果在瓊脂對(duì)照平板上出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對(duì)照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會(huì)因?yàn)樵谙♂屵^程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對(duì)含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋，則需采用蒸餾水。
2、樣品稀釋
檢樣稀釋時(shí),無(wú)菌稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或ml)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖作成1:10的稀釋液。制備10倍系列稀釋的樣品勻液時(shí)，每一步都應(yīng)該搖勻試管或反復(fù)吹吸，使菌體能夠盡量分散均勻。如系肉、魚等固體樣品，剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中，以8000-10000rpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1：10稀釋液。對(duì)于像食醋或酸性飲料等酸度較高的樣品，如果直接用原樣液來檢測(cè)菌落總數(shù)，結(jié)果會(huì)偏低甚至為0，只有嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)要求先用滅菌的20-30%碳酸鈉溶液將其PH值調(diào)至中性后方可準(zhǔn)確檢測(cè)出菌落總數(shù)[3]。
根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，將上述1：10的檢樣稀釋液再做成幾個(gè)適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1：10稀釋液1ml與9ml稀釋液混和做成1:100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1：1000、1：10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另?yè)Q1支1ml滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時(shí)，不要將吸管碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分;；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時(shí)，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因?yàn)檫@些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm；吸入液體時(shí)，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管離開液面，將貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準(zhǔn)確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時(shí)不會(huì)有多余的液體粘附于管外。
當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時(shí)，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
3、平板接種與培養(yǎng)
將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時(shí)，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇2—3個(gè)適宜稀釋度，分別在作1O倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移lml稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋)，后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個(gè)稀釋度應(yīng)作2個(gè)平皿。
培養(yǎng)溫度，應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng)，水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為48±2h。其他食品，如清涼飲料，調(diào)味品，糖果、糕點(diǎn)．果脯，酒類(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌萊均系用37℃24±2h培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時(shí)間之所以有這種不同的區(qū)分，是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時(shí)，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時(shí)間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
4、菌落計(jì)數(shù)
在進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，有一些樣品的殘?jiān)鼤?huì)在視覺上與菌落混淆，因此，在進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)該仔細(xì)分辨。菌落的形狀相對(duì)規(guī)則，比較有光澤度，更飽滿，而樣品的殘?jiān)容^不規(guī)則，沒有菌落的飽滿度和光澤度。另外，還可向培養(yǎng)基中添加一定濃度的TTC，可以使菌落成紅色，便于觀測(cè)和計(jì)數(shù)，但TTC的濃度不宜過高，否則會(huì)抑制菌落的生長(zhǎng)[4]。
從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個(gè)平皿和不同稀釋度的幾個(gè)平皿內(nèi)平板上菌落生長(zhǎng)情況。平行試驗(yàn)的2個(gè)平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近，不同稀釋度的幾個(gè)平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大，菌落數(shù)越低，稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。
5、菌落計(jì)數(shù)所得結(jié)果，可分別按以下幾種不同情況作報(bào)告。
若1個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在30—300之間，則將該菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告之。
若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30—300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)。
若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。
若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。
